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    关于RNA提取怎能缺了这些小技巧!

    发布者:博迈德生物2019-01-15104

    今天小编要给大家推送的这篇文章,是有多年RNA提取经验的科研大神为大家总结的精华干货,解决大家在全血RNA和植物RNA提取方面遇到的问题。一起来学习一下前辈们的经验,定会让你受益匪浅~


    【全血RNA提取】


    全血RNA提取步骤:


    从血液中提取RNA是一种常见的分子生物学实验,可用于反转录、RNA干扰等研究。

    一般的实验思路

    对血液样本进行抗凝处理

    裂解红细胞,分离出白细胞

    加Trizol后按常规方法进行抽提

    ↓ ↓ ↓

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    全血RNA提取需注意的细节:


    (1)血液样本的保存


    血液样本不稳定,因为其中含有丰富的RNA酶,易导致RNA的降解,新鲜的血液应尽早处理,分离出白细胞。


    在实验之前血液可以室温条件存放2h左右,但是不宜冻存,冻融后的血液即使能很幸运地提出RNA,浓度与纯度也会大打折扣。


    (2)质量更重要


    吸取上清一定不要吸到中间层的蛋白,如果吸到蛋白一定要重新用氯仿抽提,因为,吸到的蛋白很可能会对RNA产生降解作用。一定要少吸,不要贪多,RNA提取质量更重要。


    (3)RNA溶解


    RNA不要过度干燥,这样不利于溶解。为了彻底溶解,必要时可以65℃加热5分钟。


    (4)操作习惯


    经常更换手套,操作时戴口罩,以防RNA酶的污染。


    氯仿分相后的上清中已经没有了RNase的抑制剂,所以分相后的所有操作要特别小心,保证使用的离心管和枪头都是RNase-free的。


    如果可能,实验室应专门辟出RNA操作区,离心机,移液器,试剂等均应专用。RNA操作区应保持清洁,并定期行除菌。


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    【植物RNA提取


    植物RNA提取过程


    植物组织成分相对于动物组织来说复杂多样,因此其RNA的分离和纯化的难度也随之加大,如果要完美的数据结果,那么提取纯度高、完整性好的RNA就成了关键所在。


    植物RNA的提取一般会经历以下几个过程:


    1.破碎细胞壁


    2.裂解细胞膜


    3.杂质去除,包括:DNA、蛋白质、多糖、多酚、次生代谢产物等


    4.纯化和浓缩RNA


    而在RNA提取过程中,纯化除杂的过程是影响RNA纯度的关键所在。在完整的细胞内,多糖多酚类化合物,次级代谢产物,蛋白质如RNase等与核酸是分离的,一旦细胞破碎,这些物质就不可避免的会与RNA发生相互作用。下面我们一起来看看RNA纯化过程中会出现的4类问题以及相应的应对策略↓↓↓



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    问题与策略


    (1)酚类物质的纯化


    Question:


    植物组织中果实部分以及树木类植物中富含酚类化合物,其会随着植物器官的增长而增加,此外针叶类植物中所含有的酚类化合物要比落叶植物的叶子中更多。植物组织经破碎处理后,释放酚类物质,随后酚类物质被氧化,氧化后的处理液逐渐变为褐色,并随氧化程度的增加而加深,这一过程被称为褐化效应,而酚氧化后形成的醌能与RNA结合,导致RNA活性丧失,而用苯酚、氯仿抽提时,RNA还会丢失或形成不溶性复合物,从而影响RNA的分离纯化。


    Answer:


    1.植物组织采集过程中应尽可能采集幼嫩组织,对组织进行冷冻保存,并在短时间内提取RNA;对于采集回的样品如要长期保存,应经液氮处理后储存在-80℃冰箱,且在样品与裂解液接触前,应防止冷冻的样品解冻,否则酚易被氧化成醌。


    2.为防止多酚氧化,在裂解样品的同时可以加入适量的抗氧化剂。


    PS:β-巯基乙醇是个不错的选择,它可以抑制氧化反应;


            PLANTaid (博迈德, RA107)也是个不错的选择。


    Notice:如果植物是茶类、紫荆类,推荐一款不错的ope体育客服电话— EASYspin植物RNA快速提取ope体育客服电话(博迈德,RA106),这些都是妹纸在实验中摸索出来的哦~


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    (2)多糖类物质的纯化


    Question:


    多糖作为植物细胞的结构组成和营养物质在植物细胞中大量存在,它是干扰植物RNA提取的主要因素,它的许多理化性质与RNA相似,因此很难将它们分离。另外多糖可与RNA结合形成胶状物质,这不但影响实验的操作,而且可以通过引起酶的活性中心改变或必需基团的改变而抑制酶的活性,严重影响分子生物学实验的后续工作。


    Answer:


    1.在常规的提取方法中,通过盐酸胍处理可以去除部分多糖;在高浓度Na+或K+存在条件下,通过苯酚、氯仿也可以除去一些多糖;此外还可以通过LiCl沉淀RNA,将部分多糖保留在上清液中,但该法易丢失miRNA。但即使通过这些方法仍会有相当大一部分多糖与RNA缠绕在一起难以分离,所以需要更有效的解决方案。


    (3)蛋白质纯化


    Question:


    RNase和多酚氧化酶都属于蛋白质,要想获得高质量、完整的RNA,必须对有蛋白质污染的样品RNA进行纯化操作。


    Answer:


    1.裂解液中加入蛋白质变性剂,如异硫氰酸胍,2-巯基乙醇,SDS等可去除大部分蛋白质。


    2.可以利用蛋白酶K降解蛋白质,最后再用苯酚/氯仿除去残留的蛋白质。


    (4)次级代谢产物的纯化


    次生代谢产物是指某些生物利用某些初生代谢产物为原料,在一系列酶的催化下,形成一些特殊的化学物质,这些化学物质即为次生代谢产物,这是一类非生长所必需的小分子有机化合物,但对于植物自身在复杂环境中的生存和发展起着不可替代的作用,如生物碱、黄酮类、萜类、有机酸、木质素等。


    Question:


    许多高等植物尤其是成熟组织能产生某些水溶性的次级代谢产物,这些产物很容易与RNA结合并被共同抽提出来,进而阻碍RNA的分离。


    PS:因不确定这些代谢产物具体是什么物质,目前还没有特别好的方案来解决这一问题,不过大家可以尝试使用选择性沉淀来纯化。


    内容来自网络综合 如侵删
    END


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