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    有了它,Marker实验就简单多了!

    发布者:博迈德生物2019-01-08105

        本文小编要和大家分享由博迈德技术部科研达人总结的DNA marker使用中的常见问题及解决方案,有了它,做Marker实验就简单多了!一起来看学习吧!


    1. DNA条带不见或很淡,可能的原因及解决的方法。


    (1)DNA Marker上样量太少。


    请按照说明书加样,或者根据自己的实验样品调整加样。


    (2)DNA条带电泳时跑出凝胶。


    BM DNA Marker中有两种染料(青色染料和黄色),在1%的琼脂糖凝胶中青色染料与 3-5 kb DNA条带迁移速率相同,黄色染料约与50 bp DNA条带的迁移速率相同,电泳时,最好不要将黄色染料跑出胶外。


    (3)DNA条带被示踪染料所遮盖。


    选用不同的电泳loading buffer,使待检测的DNA样品避开示踪染料的干扰,或者适当降低loading buffer用量。


    (4)凝胶中未加核酸染料(如溴化乙啶(EB)、GelGreen、GelRed和SYBR Green I),或者后染时核酸染色不均匀。


    比如过夜存放的凝胶中的核酸染料(溴化乙啶(EB),GelGreen,GelRed,SYBR Green I)会分解很多,第二天使用,DNA条带明显变弱。因此加入核酸染料的凝胶最好是当天使用。少数剩余的凝胶想第二天使用,放入袋中密封避光保存。


      (5)核酸染料(如溴化乙啶(EB)、GelGreen、GelRed和SYBR Green I)染色DNA后,采用不合适的紫外光源观察凝胶。


    使用短波长(254nm)的紫外光以获得更大的灵敏度。


    (6)凝胶经长时间紫外线照射后,荧光褪色。


    再次用核酸染料(如溴化乙啶(EB)、GelGreen、GelRed和SYBR Green I)染色凝胶。


     


    2. 条带弥散模糊或分离不开条带


    (1)DNA有部分降解,核酸酶污染,保存不当。  


    每次吸取时更换灭菌枪头以免电泳缓冲液带入管中,造成核酸酶污染。  


    (2)样品的盐浓度过高。


        使用酚/氯仿抽提或乙醇沉淀法除去样品杂质。


    (3)电泳时间过短。


    使用DNA Marker,依据样本DNA的长度,合理调整一下电泳时间。


    电压降是指使用的电压(V)与两个电极距离(cm)的比值。


    当电压降为4-10 V/cm,电泳效果比较好。


    (4)DNA上样量过大,条带变粗,条带间不易分离。


    适当减少加样体积,可以明显的改善电泳后DNA的带形。


    (5)使用不合适浓度的琼脂糖凝胶。


    进行琼脂糖凝胶电泳时,琼脂糖凝胶的浓度与 DNA 片段的分离性能关系密切。琼脂糖凝胶浓度越大,对短片段DNA分离性能越好。反之,琼脂糖凝胶浓度越小,越有利于长片段DNA的分离。例如,1%的琼脂糖凝胶适合1kb Marker而不适合100bp Marker。100bp Marker 在2%的琼脂糖凝胶中电泳效果好而在1%的琼脂糖凝胶中效果很差。1kb Marker在2%的琼脂糖凝胶中几乎分不开。


    (6)凝胶质量差,凝胶凝固不均匀,电泳缓冲液多次使用。


    使用高质量的凝胶,电泳缓冲液多次使用后,离子浓度降低,pH值上升,缓冲能力减弱,从而影响电泳的效果,建议经常更换电泳缓冲液。


    (7)电泳后染色时间过长或拍照前放置过久。


    放置时间过长,DNA在琼脂糖凝胶中会扩散导致条带模糊。因此电泳结束后需立刻观察,必要时拍照记录结果。


     


    3.c样品条带与DNA marker相比,出现大小不一致的现象


    (1) 质粒样品跑电泳时其条带与其相对应大小的Marker 条带不一致。


      质粒通常为超螺旋结构,电泳时肯定与线性的DNA Marker条带不一致。如果想要与


    DNA Marker条带一致,需要将质粒通过酶切等方法线性化。


    (2) 样品中盐离子与DNA Marker中的盐离子浓度不同。


      盐离子浓度不同,导致带电量的不同,因此电泳时相同的电压和时间下,迁移速率不同。


    制备高纯度的样品,并尽量选用同一家的DNA Marker和loading buffer。


    (3) 样品的上样量过多或过少。


      根据样品中DNA的浓度选择合适的点样孔并调整上样量,样品上样量要完全覆盖点样


    孔底部,而不是聚在点样孔一侧。例如,使用50 μl体系酶切5 μg质粒后进行胶回收纯化,建议将酶切产物加入到3-4孔由13齿梳子制成的1%琼脂糖凝胶的加样孔中进行电泳并切胶回收。这样既能保证每个加样孔中的DNA含量适当,同时,上样体积覆盖点样孔底部,电泳条带清晰明亮。    


     


    4. DNA带形异常  


    (1)上样量过大或过小。  


    选择合适大小的上样孔,样品上样量要完全覆盖点样孔底部。  


    (2)核酸样品纯度差,含有DNA结合蛋白或高浓度盐分。  


    酚/氯仿抽提或乙醇沉淀去除蛋白、盐分等杂质 。


    (3)电泳缓冲液未完全浸没凝胶,电泳缓冲液陈旧。  


    确保缓冲液始终能完全覆盖凝胶,经常更换电泳液。  


    (4)电压过高或电泳时间过长致使凝胶过热和DNA变性。  


    根据凝胶大小和电泳缓冲液类型,使用适当的电压进行电泳。


    电压降在4-10 V/cm进行电泳效果比较好。


    (5)凝胶质量差,凝固不均匀都会出现不规则的条带。


    使用高质量的琼脂糖,制备凝胶时,待凝胶完全凝固后再取出梳子 。


    (6)电泳仪中铂金丝弯曲,导致两条铂金丝之间的距离不等。


    确保电泳仪两极的铂金丝顺直。


     


    5. 为什么DNA Marker缺带


    (1)小条带可能跑出凝胶。


    可适当缩短电泳时间,降低电压,最好不要将Marker中的黄色染料跑出胶外。 


    (2)琼脂糖凝胶浓度不合适,导致DNA Marker中的条带分离不开。


    选择合适浓度的凝胶进行电泳,琼脂糖凝胶浓度越大,对短片段DNA分离性能越好。反之,琼脂糖凝胶浓度越小,越有利于长片段DNA的分离。例如,1%的琼脂糖凝胶适合1kb Marker而不适合100bp Marker。100bp Marker 在2%的琼脂糖凝胶中电泳效果好而在1%的琼脂糖凝胶中效果很差。1kb Marker在2%的琼脂糖凝胶中几乎分不开。


    (3)DNA Marker上样量过大,导致DNA Marker中各条带变粗,条带间不易分离。


      根据DNA Marker说明书适当调整DNA Marker上样量。


     


     


    6.z定量数据不正确


    凝胶电泳法定量,即用已知条带大小和浓度的DNA为参照物(如DNA Marker)来定量未知样品中DNA的含量,属于半定量的方法。未知样品和DNA Marker同时进行电泳,电泳完成后使用凝胶成像仪成像并对成像结果中的未知样品的条带和DNA Marker的条带进行灰度和位置比对,得到未知样品中DNA条带大小和浓度。以下因素会影响DNA定量结果:


    (1)未知样品上样量过多,导致条带过粗,定量结果不正确。


        适当调整样品上样量,或进行梯度上样。


    (2)凝胶的不均匀染色或背景过高都会干扰凝胶定量结果。


    使用后染法染色凝胶时,确保凝胶完全浸没在核酸染料(如溴化乙啶(EB)、GelGreen、GelRed和SYBR Green I)中,且染料浓度不要超过推荐用量,染色时间不要超过30分钟,否则会导致高背景染色。


    碱性琼脂糖凝胶电泳后,将凝胶浸入300 ml 0.5 M Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)中处理30分钟,然后再用核酸染料溶液染色30分钟。变性聚丙烯酰胺/尿素凝胶电泳后,将凝胶浸入1×TBE缓冲液中15分钟除去尿素,然后再用1×TBE缓冲液配制的核酸染料(如溴化乙啶(EB)、GelGreen、GelRed和SYBR Green I)染色15分钟。


    (3)DNA条带被电泳示踪染料掩盖。


    选用不同的电泳loading buffer,使待检测的DNA样品避开示踪染料的干扰,或者适当降低loading buffer用量。


     


    7. GelRed和GelGreen可以用来使用染BM DNA Marker凝胶吗?


    可以,核酸染料(GelRed和GelGreen)会对DNA有一定的迁移影响,建议使用后染法染色凝胶。


     


    8. BM DNA Marker的末端功能集团是什么?


    BM DNA Marker是通过酶切质粒得到相应大小的条带,因此其末端的功能集团为


    5’-磷酸和3’-羟基。


     


    9. 用DNA Marker电泳的推荐电压是多少?V/cm是什么意思?


    一般在80-200 V。


    V/cm为电压降的单位,电压降是指使用的电压与两个电极距离(cm)之间的比值。


    当电压降为4-10 V/cm,电泳效果比较好。


     


    10. BM DNA Marker 是由线性还是环状DNA组成?


    BM DNA Marker是由线性的双链DNA组成。


     


    11. PCR产物或DNA Marker条带拖尾或背景不干净


    (1)上样量太高。


      (2)琼脂糖质量不好。


      (3)样品纯度不好,盐离子浓度过高。


     


    12. DNA Marker 异常不规则的迁移


    (1)使用不当的电泳条件。


    不允许电压降超过20 V/cm。在电泳过程中保持温度低于30。建议经常更换电泳液。


    (2)凝胶未完全浸没在缓冲液中。


      确保凝胶完全浸没在缓冲液中。


    (3)Marker被加热,就会发生这种情况。


    常用的DNA Marker不需要加热处理。加热后双链DNA变性成单链DNA,导致DNA


    条带混乱。


    特例:λDNA制备的酶切Marker有条带亮度减弱或少条带时,可将Marker置于65保温5 min,冰水上3min 处理,使λDNA末端12个碱基的COS位点分开。


     


    13. 如果两条低分子量DNA且分子量大小相近,如何分离?


    建议增加琼脂糖凝胶的浓度,如2%-3%。3%琼脂糖凝胶可以区分分子量相差约20 bp的DNA条带。


     


    14. 如何选择DNA Marker


    本公司的BM DNA Marker 包括了从50 bp-15 kb区间的条带,可以满足你所需要的条带大小。例如,如果条带大小在100-2000 bp之间,建议使用BM 2000/BM 2000+。如果条带在2000-5000 bp之间,建议选择BM 5000/BM 5000+。如果大于5000 bp,建议使用1kb Ladder/BM 15000/BM 8000等。


       请根据条带的大小选择合适的Marker,并使用合适浓度的琼脂糖凝胶进行电泳。


     


    15. DNA 留在点样孔处?


    DNA 留在点样孔的主要原因是DNA不带电荷。与下面的因素有关:


    (1)凝胶中的离子强度与电泳缓冲液中的离子强度不同。


    配置凝胶所用缓冲液与电泳时所用缓冲液保持一致。


    (2)上样过量


    (3)DNA样品结合有大量蛋白,或DNA样品污染


       可使用加入SDS的loading buffer 进行电泳,或重新制备样品。


     


    16.0BM DNA Marker的特点


    本公司生产的DNA Marker均通过酶切质粒得到,该工艺生产的Marker背景干净、条带清晰,质量稳定且能实现对Marker精确定量。


    产品含有两种染料(青色染料和黄色染料),电泳时可通过颜色变化判断电泳的迁移速率,在1%的琼脂糖凝胶中,青色染料约与3-5 kb DNA条带的迁移速率相同,黄色染料的约与50 bp DNA条带的迁移速率相同,肉眼可直接观察电泳进度,使用方便且电泳图像清晰。

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